Micropropagation of GF 677 Rootstock
a) Explants collection and sterilization 
1. Collect the dormant stems from the field in dormant period
2. Cut it up to 3-4 cm and store  at +4C in refrigerator







3. For Sterilization of the explants, put about 50 stem cuts of the mentioned rootstock(every stem  should have at least one bud) in a 1000ml Pyrex  beaker  with 250 ml of distillated water on the magnetic  starrier for 5 minutes 
4. After five minute, rinse 2 times with distillated water and put it again on magnetic stirrer with 250 ml of distillated water, add 10 drops of Tween 20 in to the beaker for 5 minutes 
5. Rinse 7 times with distillated water, then spray the beaker with ethanol and put it in laminar air  flow cabinet.
6. Pour 250 ml of sterile distillated water with 125 mg of Hg Cl2 on the stems for 7 minutes 
7. After 7 minutes, remove the stems from Hg Cl2 solution and then pure 250 ml Ethanol 70% in to the sterile bottle and put the stem cuts in to ethanol for 7 minutes.


8. Rinse stem cuts three times with sterile distilled water under the laminar air flow condition and cultivate in MS 1mg/l GA3
9. Put it in growth room 16 hours light period, with 3000 lux of intensity and 25±2 C˚ temperature.















b) Multiplication of the rootstock in vitro

1. During the 20 days, it will produce some shoots, take the new culture under the laminar air flow condition  and culture it again in MS 1mg/l GA3  




2. After 15-20 days it will produce some lateral  shoots, then those shoots can be sub cultured  to the media for multiplication 







MS media  
Micro elements 1 liter Media(mg) Macro elements 1 liter Media(mg)
Co Cl2 .H2O             0.0163 CaCl2.2H2O 439.5898
CuSO4. 5H2O           0.025 KH2PO4                             170
H3Bo3                         6.2 KNo3 1900
KI                                 0.83 MgSO4 180.54
MnSO4 . H2O           16.9 NH4 NO3                         1650
Na2MoO4.2H2O       0.25 Vitamins  
Zn So4 . 7H2O           8.6 Glycine 2
Seme microelements Myo-Inositole 100
Na2EDTA.2H2O                     37.22 Nicotinic acid 0.5
FeSO4.7H2O 27.802 Pyridoxine HCl 0.5
  Thiamine HCl 0.1
        Sucrose 25 g /l, GA3 1mg/l, Agar,6.5 g/l 


c) Transplanting the plantlets in to rooting media
1. When the size of new cultures  reach  to 2-3 cm, then it can be  transplanted it into half concentration of 0.2 mg/l IBA + 0.1 mg NAA  MS media.
2. Put it in growth room at 23-27 C°  in a carton (dark place) for two days. 
3. After two days, put it on the shelves at 16 hour light period, with 1000 lux intensity of light and  25±2 C˚ temperature. it will produce roots during the 20 days.






Half MS Media for Rooting 

Macro elements Half Concentration 
Sucrose 15 gr/l 
Fe + Na2 EDTA Full Concentration
Micro elements Full Concentration
Vitamins Full Concentration
              0.2 mg/l IBA + 0.1 mg NAA/l, two days in dark, 
d) Acclimatization of rootstock 
1. Transfer the rooted plantlets with vessels in to green house for about one week.
2. After one week remove the plantlets from the vessels and cultivate it in the peat moss in multi cell tray at in green house for acclimatization, after 2-3 weeks  the plantlets can be transplanted to the field.

Post has attachment
PhotoPhotoPhotoPhotoPhoto
Gisela 5 plantlets that produced it Tissue culture Unit in plant biotechnology laboratory badam bagh
17 Photos - View album

Post has attachment
Apple dormant bud in vitro  inoculation
1)-Budsticks (from clone M9 and B9) were collected from the stoolbeds in Bagram Bagh fields.
2)-With the aid of a cutter, cut the buds and a piece of wood (same technique as for budding)  from the budsticks.
 
 
 
3)-Such explants  must be disinfected in a solution of bleach at 10% (50 ml) for 15 minutes on a stirrer and rinsed 3 times with sterile distilled water.
 
4)-After surface disinfection the buds are excised from the explants under a flow hood with the aid of a stereomicroscope making a slanting cut starting from the leaf scar.
 
5)-After the isolation, the first two scales covering the bud are removed using a scalpel. The buds were temporary put in sterile water.
 
 
               
 
6)-When a number of buds is ready, they must be sterilized in 70% ethanol (100 ml) for 10 minutes and then in 30% bleach solution (100 ml) for 30 minutes (B9) (M9 has been sterilized for 60 minutes).
 
7)-The sterilization was followed by 3 wash with sterile distilled water for 5 minutes each.
 
8)-The buds were then inoculated under the hood in test tubes containing 10 ml of MS 0, 25 g/l sucrose, pH 5.5. The test tube with cotton plug could dry the explants, therefore the cotton plug was enveloped into a sheet of plastic foil. Better use test tubes with plastic lid.
Photo
Photo
2 Photos - View album

Post has attachment
کشت انساج نباتی (Tissue culture)
تشیوکلچر : تشیوکلچرعبارت کشت نسج ویا حجره نباتی جدااز اوگانیزم های دیگر آن دریک محیط کنترول شده به منظور بدست آوردن نباتات عاری از ویروس و امراض.
محیط کنترول شده : عبارت از محیط است که در آن حرارت، رطوبت، شدت نور، مقدار نور تحت کنترول مان باشد.
یک لابراتوار تشیوکلچر باید حد اقل دارای چهار اطاق (Growth room, Multiplication room, media preparation room, and washing room ) باشد، که اطاق های رشد نبات و کشت نبات باید کاملاً تعقیم شده و پاک باشد.
تمام ابزار که در لابراتوار از آن استفاده صورت میگیرد باید کاملاً تعقیم گردد ، آن عده از ابزار که قابلیت ایتوکلف را دارد باید ایتوکلف شود و بقه بایدتوسط محلول های تعقیم کننده ( ایتانول ، الکول، سودیم هایپوکلوراید، کلوراکس ) تعقیم گردند تا از مصاب شدن نبات توسط قارچ ها و بکتریا ها جلوگیری به عمل آید.
فواید تشیوکلچر:
1.       نبات کاملاً سالم عاری از ویروس و امراض بدست می آید.
2.       نبات مطابق نوع (True to type) بدست می آید.
3.       دروقت کم نبات زیاد بدست می آید.
4.       درجای کم نبات زیاد بدست می آید.
5.       به پرسونل کم کار زیاد صورت میگیرد.
6.       نبات که در ساحه آزاد به مشکل تکثیر میگردد در تشیوکلچر به بسیار آسانی تولید میگردد.
7.       با استفاده از (Micrografting) در تشیوکلچر از نبات مصاب نبات سالم بدست آورده میتوانیم.
8.       با استفاده از اکسین ها نبات به آسانی و در مدت کم ریشه تولید میکند.
9.       تولید نهال های که در ساحه آزاد بسیار به سختی تولید ریشه مینماید.
چون وقتی ویروس ها داخل یک نبات میگردند همزمان با نبات به تکثیر خود ادامه میدهند و خوشبختانه رشد ویروس ها نسبت به رشد نبات بطی بوده و نمیتواند به پندک بالائی نبات ( مرستیم) برسد، بناً باید بلند ترین نقطه نبات که در آن ویروس نه رسیده باشد برای کشت دوباره گرفته شود.
بدست آوردن نبات سالم از نبات مصاب به ویروس به طریقه های ذیل صورت میگیرد:
1 – (Heat treatment) : در این طریقه یک نبات مصاب به ویروس را که در گلدان جابه جاکرده وآن را در داخل یک چمبره که رطوبت 100% وروشنائی 24 ساعت داشته وحرارت آن تحت کنترول باشد میگذاریم طوری که اپتدا آن را در درجه حرارت 25 قرار داده تا نبات رشد کند وبعد از 55-60 روز درجه حررارت را یک یک درجه بلند میبریم وبه C 37-38 میرسانیم ، چون با بلند رفتن درجه حرارت رشد ویروس بسیار ضعیف میگردد و بعداً میتوانیم قسمت بالائی نبات را از 2-4 ملی متر که ویروس در آن نه رسیده است قطع نموده وبه پایه مادری سالم پیوند میکنیم.
 
2 – (Meristem culture): دراین طریقه اپتدا پندک نهائی نبات مصاب را توسط ابزار برنده قطع مینمایم و بعداً آن را آن توسط محلو های ایتانول و سودیم هایپوکلوراید تعقیم نمودن و مرستیم آن را درداخل لیمنارآیرفلو توسط  فارسپ ، سکالپل، وسوزن سورنج در زیرمایکرسکوپ جدامیسازیم وبعداً آن را بالای نهالی تولید شده که از تخم نبات در لابراتوار داخل مدیا تولید گردیده زیزه پیوند مینمایم.
3 – (Thermograph fallow by meristem culture ): دراین طریقه که بهترین و مطمئن ترین طریقه برای تولید نبات سالم است اپتدا بالای نبات عملیه ترموترافی را انجام داده و بعد پندک نهائی آن را قطع نموده و مرستیم آن را جدامیسازیم و بالای نهالی تخمی تولید شده در لابراتوار ریزه پیوند مینمایم.
 
Photo
Wait while more posts are being loaded