Profile cover photo
Profile photo
Евроген
2 followers -
Продукты и услуги для молекулярной и клеточной биологии
Продукты и услуги для молекулярной и клеточной биологии

2 followers
About
Евроген's posts

Post has attachment
Photo

Post has attachment
Генетика вашей привычки пить кофе
У людей найден ген, который способствует потребление кофе.

С 1960-х годов, исследователи пытались выяснить, что определяет нашу тягу к кофе. Первые генетические исследования по этой теме использовали опросы, семейные истории, а также исследования близнецов, чтобы раскрыть наследственный характер потребления кофе в Италии. Перенесясь в нынешнюю эпоху высокопроизводительного секвенирования, исследователи теперь связали несколько генов с побуждением к кофе, в том числе гены, чьи соответствующие белки являются эффекторами кофеина и те, которые предположительно играют роль в метаболизме кофеина. Но даже с учетом этих достижений, у нас до сих пор нет четкого представления о том, что влияет на нашу кофейную привычку.

После изучения текущих исследований, Никола Пиратсу (Nicola Pirastu) с коллегами из Университета Триеста в Италии (University of Trieste in Italy) поняли, что большинство исследований по полногеномному поиску ассоциаций нацеленных на привычку к кофе не рассматривают рецессивные или доминантные эффекты, и поэтому, возможно, пропустили некоторые важные аллели. Чтобы проверить эту идею, команда Пиратсу провела свой собственный полногеномный поиск ассоциаций, чтобы специально искать неаддитивные эффекты генов на потребление кофе. Приводя свои результаты в журнале Scientific Reports, команда впервые показала, что ген PDSS2, по-видимому модулирует сколько человек пьет кофе, путем регуляции экспрессии генов, связанных с метаболизмом кофеина.

Для своего полногеномного поиска ассоциаций, Пиратсу с коллегами использовали 370 и 843 образцов из двух изолированных итальянских популяций, а также 1731 образцов из голландской популяции. Каждый человек участвовавший в исследовании записывал, сколько чашек кофе он пил каждый день. Используя массив SNP высокой плотности от Illumina, исследователи затем генотипировали участников и, используя рецессивную модель, нашли 21 значимых SNP, соответствующих разности в 1,2 чашек кофе в день. Важно, что все выявленные SNP находились внутри гена PDSS2, который кодирует коэнзим Q10.

Предыдущие исследования с использованием мышиных моделей показали, что отсутствие гена PDSS2 увеличивает экспрессию генов в пути метаболизма кофеина. В человеческих образцах, данные Пиратсу показали, что некоторые SNP снижали экспрессию PDSS2 во многих тканях и это приводило к увеличению потребления кофе.

Хотя эти данные указывают на возможный механизм, посредством которого эти SNP изменяют тягу к кофе, необходимо провести еще работу, чтобы дополнить детали. "Нам нужно сделать более крупные исследования, чтобы подтвердить открытие, а также прояснить биологическую связь между PDSS2 и потреблением кофе," говорит Пиратсу.

Pirastu N, Kooyman M, Robino A, van der Spek A, Navarini L, Amin N, Karssen LC, Van Duijn CM, Gasparini P. Non-additive genome-wide association scan reveals a new gene associated with habitual coffee consumption. Sci Rep. 2016 Aug 25;6:31590.

Перевод оригинальной статьи Кристи Нюбо (Kristie Nybo, PhD) на сайте журнала Биотехнологии.

http://www.biotechniques.com/news/The-Genetics-of-Your-Coffee-Habit/biotechniques-364995.html#.V8fvM_mLSUk

#evrogenscience #кофе

Post has attachment
Photo

Двухцепочечная ДНК находит совпадение

Принимая во внимание сложность среды в которой находится ДНК внутри клеточного ядра, трудно себе представить, как комплементарные регионы находят друг друга в процессе гомологичной рекомбинации. Теперь, исследователи показали, что гомологичные последовательности двухцепочечной ДНК могут физически связаться друг с другом в последовательность-специфичной манере и без помощи белков.

Гомологичная рекомбинация — это обмен ДНК между двумя молекулами двухцепочечной ДНК (дцДНК), содержащими регионы, которые подобны или идентичны по нуклеотидной последовательности. Этот процесс играет важную роль во многих клеточных функциях, включая ремонт повреждений в ДНК и генерации генетического разнообразия в гаметах в процессе мейоза. Но прежде всего, две гомологичные последовательности должны спариться. Вопрос заключается в том, каким образом?

Учитывая сложность среды клеточного ядра, в которой находится ДНК, суперскрученная вокруг себя и упакованная вместе с белками и РНК с образованием хроматина, это не удивительно, что белки, такие как кохезин (cohesin) и конденсин (condensin) облегчают спаривание молекул ДНК для рекомбинации. Тем не менее, гомологичные последовательности в молекулах дцДНК могут также физически ассоциировать в среде без белков. Механизм этой последовательность-специфичной аффинности не совсем ясен, но, вероятно, включает в себя ионные заряды на самих молекулах ДНК, ионы ассоциированные с ДНК, а также искажения в спиральной структуре ДНК.

Теперь исследователи из Гарвардского университета (Harvard University) и Имперского колледжа в Лондоне (Imperial College London), показывают, что две гомологичные области на той же молекуле ДНК способны к спариванию. "Мы рады, что увидели такое поведение в пробирке", говорит Алексей Корнышев (Alexei Kornyshev), один из авторов статьи в журнале Proceedings of the Royal Society.

Гарвардский исследователи провели эксперименты расширения силой единичных молекул, в которых 60-т.п.н нити ДНК, содержащие два идентичных 10 т.п.н. региона были привязаны к твердой поверхности голова к голове на одном конце и магнитной частицей на другой, в простом фосфатно-буферном растворе (PBS). С помощью оптического пинцета, магнитное поле, оказывающее усилие на частицу, расширяло молекулу ДНК. При низких уровнях силы, ДНК содержащая две гомологичные области образовывали структуру «петли» и были поэтому менее растянуты, чем контрольные молекулы ДНК, не имеющие последовательностей внутренней гомологии.

"Доказав взаимодействие между идентичными последовательностями в единичных молекулах ДНК в этих новых экспериментах, следующим шагом будет дополнительное исследование механизма распознавания," говорит Доминик Ли (Dominic Lee), ведущий автор статьи.

Ли с коллегами из Имперского колледжа Лондона проанализировали данные расширения под действием силы, заключив, что спаривание гомологичных регионов носит динамический характер. Они также изучили поведение спаренных регионов, при увеличении силы, разрушая структуру петли, образованной двумя идентичными последовательностями. Авторы затем подобрали для данных две различные теоретические модели, показав, что одна может лучше описать механику разворачивания ДНК при низких уровнях силы, в то время как другая может быть более подходящая на более высоких уровнях силы.

Степень спаривания ДНК также изменялась с температурой и составом буфера; тем не менее, внутриклеточная среда является гораздо более сложной, чем простой буферный раствор, поэтому многие различные факторы могут влиять на способность гомологичных последовательностей спариваться in vivo. "Независимо от этого, мы также надеемся, что новые результаты вызовут эксперименты в реальных клетках, чтобы увидеть, если процесс распознавания происходит таким же естественным образом, для гомологичных генов", говорит Ли.

"Если такие механизмы, каким-то образом используются в природе, это еще одна функция закодированная в удивительной структуре ДНК, которая никогда не перестает удивлять нас.", говорит Алексей Корнышев

O'Lee DJ, Danilowicz C, Rochester C, Kornyshev AA, Prentiss M. Evidence of protein-free homology recognition in magnetic bead force-extension experiments. Proc Math Phys Eng Sci. 2016 Jul;472(2191):20160186.

Перевод оригинальной статьи Ами Волперт (Amy Volpert) на сайте журнала Биотехнологии.


http://www.biotechniques.com/news/Double-stranded-DNA-Meets-its-Match/biotechniques-364987.html#.V8U2FfmLSUk

#evrogenscience #ДНК #гомология

Post has attachment
Редактирует или нет: история NgAgo

Сообщения о новых подходах для редактирования генома всегда получают широкое внимание. Но в случае новой методики на основе белков Argonaute, опубликованной весной этого года, внимание было особенно интенсивным.

В постоянно растущем массиве приложений, появляющихся в научной литературе, на данный момент самой “горячей” технологией в молекулярной биологии остается CRISPR / Cas9. Тем не менее, по-прежнему существует значительный интерес к переработке и расширению существующих инструментов редактирования генома для более эффективного использования. Вслед за расширением технологии CRISPR, исследователи разработали, на основе белков Argonaute, подход для редактирования генома, который, казалось, преодолевает некоторые из недостатков технологии CRISPR.

С намерениями добавить новый инструмент в копилку методов для модификации генома, ученые погрузились в вихрь экспериментов, что привело к большому количеству вопросов при анализе данных.
Новый способ редактирования генов

В мае 2016 года, Чунью Хан (Chunyu Han) с коллегами из университета Хэбэй (Hebei University) сообщили в журнале Nature Biotechnology, что белки Argonaute из бактерии Natronobacterium gregoryi (NgAgo) могут функционировать как ДНК-направленные эндонуклеазы, способные редактировать геном в клетках человека. Результаты выглядели мощно, так как, в отличие от Cas9, NgAgo, похоже не требовали протопейсер-соседствующий мотив (protospacer-adjacent motif, РАМ), что облегчало его использование для направленного редактирования генома. Кроме того, данные Хана демонстрировали, что использование NgAgo привидило к низкому уровню несоответствия направляющей-мишени и высокой эффективности при редактировании сложных матриц, таких как GC-богатых геномные участки. Эти особенности сделали новую систему особенно привлекательной для исследователей, и многие из них были готовы попробовать метод сами. По факту, согласно блогу на сайте Addgene (хранилище плазмид), который разместил постдокторант Пуран Девари (Pooran Dewari) из MRC центра регенеративной медицины (MRC Centre for Regenerative Medicine), более 400 запросов на плазмиды NgAgo были сделаны с момента публикации.

Тем не менее система NgAgo не лишена своих собственных недостатков, для in vitro сборки таргетингово комплекса NgAgo / одноцепочечная ДНК (оцДНК) требует инкубации при 55°С, на самом деле высокая температура для ферментов. Кроме того, система включает в себя котрансфекцию плазмиды NgAgo с оцДНК-направляющей для таргетирования, еще один громоздкий шаг. Тем не менее, с возможностью небольшого внецелевого редактирования, исследователи могут видеть потенциал для системы.

Научное сообщество оказалось не единственными, кто отреагировал на публикацию; редактирование генов с помощью системы NgAgo быстро добралось до новостей в масс-медиа. Один китайский новостной портал процитировал Хана, сообщившего, что в будущем, "С помощью этой технологии, мужчины среднего возраста с лысыми головами, вероятно, смогут получить свои волосы путем генетической репарации." Портал The South China Morning Post подробно рассказал о работе Хана в истории о недофинансируемых исследователях, которые делают значительный вклад в развитие науки. А на сайте журнала Nature Biotechnology, статья Хана о NgAgo получала больше скачиваний и просмотров, чем любая другая. Ожидания и интерес к NgAgo были заоблачные.

Появление “морщин”

Интернет стал местом для исследователей всех дисциплин, которые ищут, чтобы найти предложений и подсказок по улучшению своих экспериментов. Открытый обмен идеями и стратегиями стал обычным явлением в онлайн, так что не удивительно, что существует активная группа по редактированию геномов в Google сосредоточенная на методах и инструментах для модификации геномов.

Первая запись в данной группе Google, связанная с NgAgo появилась 23 июня 2016 года. Она была от исследователя, который попытался провести трансфекцию плазмиды с NgAgo, полученной из Addgene и 5'P олигонуклеотида, таргетирующего модификацию зеленого флуоресцентного белка GFP. Это должно было быть простым экспериментом, в котором в редактирование приводит к уменьшению флуоресценции GFP. Проблема заключалась в том, что, согласно сообщению, после трансфекции не наблюдалось никаких изменений в флуоресценции. Исследователь интересовался, если кто-то еще сталкивался с подобными проблемами с системой NgAgo. Через день, еще один исследователь сообщил, что они тоже пытались таргетировать гены с той же NgAgo плазмидой, и также не наблюдали ожидаемый результат редактирования.

Это не редкость для исследователей испытывать трудности с новыми методами при их первом использовании-в связи с тем, что в протоколе могут быть конкретные шаги, которые должны точно соблюдаться для достижения желаемого результата. Но после записей от 23 и 24 июня, больше ученых разместили свои данные. Со временем, возникла проблема, связанная с возникновением двух лагерей: часть исследователей считала, что система может работать, в то время как другие согласились с первыми двумя записями после того, как они также не получили ожидаемых результатов. В различных записях группы образовалась путаница.

Здесь стоит сделать шаг назад, и отметить, что исследования в области живых систем (Life Science) находятся в середине кризиса воспроизводимости. Несколько недавних публикаций высокого уровня, которые в конечном итоге должны были быть отозваны (например, относительно STAP клеток) привели к тому, что многие задают сейчас больше вопросов к новым открытиям, чем в прошлом. По состоянию на начало июля 2016 года, проверки технологии NgAgo стали все более интенсивными, и больше исследователей опубликовали свои результаты и подробности того, как они сделали свои эксперименты, и обратились за помощью в получении рекомендаций для настройки работы проверяемой технологии.

В попытке получить некоторое представление о полемике вокруг NgAgo и понять, как обстоят дела с технологией, Девари разослал опрос для пользователей, чтобы оценить успех их исследований с NgAgo. К началу августа, пришли результаты. На вопрос, наблюдались ли инделы (вставки и делеции) с использованием системы NgAgo, только 5,1% ответили утвердительно, в то время как 51,5% сказали, что нет. Использование NgAgo в других приложений для редактирования генома продемонстрировало аналогичные проценты. На основании процентного соотношения, технология NgAgo попала в беду, но вопрос остался в том, заключается ли проблема в самой технологии или в исследователях пытающихся применить ее в других лабораториях.

Консенсус это сложный путь

Хан по большей части сохранял молчание. По имеющимся данным, исследователь редко выезжает за пределы Китая. И несмотря на то, что он предоставил дополнительный протокол и подробные параметры для использования системы NgAgo, а также отметил, что исследователи в других лабораториях смогли повторить технологию, это не заставило замолчать критику. По факту, дополнительный протокол на самом деле вызвал больше беспокойств среди критиков со своими специфическими требованиями по времени и параметрами.

Возможно, на настоящий момент лучшее суммирование извилистой дороги для системы NgAgo пришло 29 июля 2016 года от Гаетана Бургио (Gaetan Burgio), лидера научной группы в Австралийском национальном университете (Australian National University), Бургио сделал всестороннюю запись в блоге о своем опыте в попытках заставить систему NgAgo работать для редактирования генов.

Первоначально Бургио сказал, что его результаты ПЦР показали, что NgAgo отредактировал ген бета-спектрина (beta-spectrin), который он таргетировал с использованием плазмиды NgAgo способом, который был похож на CRISPR / Cas9 - оправдание для NgAgo и Хана. Бургио поделился этим результатом через Twitter и сказал об этом коллегам на конференции, где он присутствовал в то время. Но вскоре после того, как первые результаты Бургио пришли и первоначальное волнение утихло, ситуация начала меняться.

В последующем эксперименте, Бургио начал видеть небольшие недостатки в данных проверки редактирования гена системой NgAgo. Другие тесты фермента, которые он попробовал, показали, что NgAgo не отредактировал ген бета-спектрина, как на то указывал первый ПЦР гель. Секвенирование продуктов ПЦР снова показали, что Бургио подозревал, может быть отредактированные последовательности. Однако, после выделения отдельных ПЦР полос и секвенирования их, Бургио, наконец, пришел к выводу, что эти последовательности были на самом деле случайными и что NgAgo редактирование никогда не происходило в его экспериментах.

Результаты и выводы Бургио только укрепили утверждение для многих, что система NgAgo просто не работает. Другие утверждают, что существуют определенные клеточные линии, и условия, которые необходимы для эффективной активности NgAgo в редактировании генов, но критики возражают, что даже если это правда, это просто означает, что метод не является надежным и, следовательно, не является жизнеспособной заменой системы CRISPR / Cas9.

Журнал Nature Biotechnology в настоящее время изучает статью по NgAgo после того, как с ним связались несколько исследователей, которые не смогли воспроизвести результаты. И университет в котором работает Хан также начал расследование.

В то время как будущее NgAgo повисло в воздухе, и ученые работают, чтобы определить, является ли фермент, на самом деле, способным к редактированию генов, опрос Девари указывает, что большинство ученых (64,5%) в настоящее время воздерживаются от экспериментов, ожидая увидеть, что произойдет. Время покажет, окажется ли NgAgo в инструментарии редактирования геномов.

Gao et al. 2016. DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nat. Biotechnol. 34, 768-773.

Перевод оригинальной статьи Натана Блоу (Nathan Blow, PhD) на сайте журнала Биотехнологии.


http://www.biotechniques.com/news/To-Edit-or-Not-The-NgAgo-Story/biotechniques-364980.html#.V7xKVPmLSUk

#evrogenscience #редактированиегенома #NgAgo

Post has attachment
Photo

Post has attachment
Упорядочение генетического кода E.coli

Ученые разрабатывают бактериальный геном содержащий только 57 кодонов.

Генетический код в норме содержит 64 кодона, но исследователи из Гарвардского университета (Harvard University) и их коллеги разработали геном Escherichia coli содержащий только 57 кодонов, массово заменив остальные. В статье, опубликованной 18 августа в журнале Science, команда описывает сгенерированный компьютером геном и отчитывается о первых этапах его синтеза в лабораторных условиях.

"Мы создаем то, что на самом деле толкает границы геномов", говорит соавтор исследования Нили Осторов (Nili Ostrov), постдок в лаборатории Джорджа Черча в Гарварде (George Church’s lab at Harvard). "Идея заключается в том, что это совершенно новое, и мы пытаемся увидеть, если она жизнеспособна."

В запланированном 57-кодонном геноме E. coli, каждый из семи удаленных кодонов заменяется на один синоним. Команда установила ряд целей для проекта. После того, как геном E. coli урезан до 57 кодонов, исследователи предполагают, что семь пустых кодонов могут быть реинтегрированы и использованы для введения нестандартных аминокислот; это возможность создания более широкого спектра белков для промышленных применений.

Перекодированный геном также придает устойчивость к вирусной инфекции и может быть использован для биосдерживания: ДНК включенная из дикого типа E.coli или вирусов не может быть использована для успешной сборки белков, когда транспортная РНК (тРНК) вставляет нестандартную аминокислоту в ответ на данный кодон. Один или несколько свободных кодонов также могут быть перекодированы к аминокислоте доступной только в лаборатории, делая сконструированные E. coli метаболически зависимыми от культуральной среды, используемой учеными.

Для разработки генома, исследовательская группа создала программный инструмент, который заменил каждый экземпляр семи кодонов на кодон-синонимы в участке ДНК, которые могут быть синтезированы в лаборатории. В общей сложности дизайн перекодированного генома содержал замены 62,214 кодонов в 3,548 генах. "Это, возможно, самый большой и радикальный проект модификации генома," говорит Черч.

Получив теоретический геном на руки, Остров с коллегами начали тестировать свой дизайн в живых клетках. Они разделили перекодированный геном на 87 сегментов, каждый длинной около 50 kb и содержащий в среднем 40 генов и передали дизайн биотехнологическим компаниям, чтобы синтезировать ДНК. Затем исследователи начали интегрировать каждый сегмент в отдельный штамм E.coli и удалять соответствующую ДНК дикого типа для проверки жизнеспособности.

"В принципе, можно сделать синтез целого генома in vitro, а затем пересадить геном," говорит Черч. Вместо этого, его команда разработала схему, чтобы получать от живых клеток обратную связь в режиме реального времени: "Сборка происходит при “работающем двигателе”", поясняет он.

В своей статье исследователи представляют результаты такой проверки для 55 из 87 сегментов генома, охватывающих 63 процента перекодированного генома. Изначальный расчетный дизайн для перекодированного генома был не совсем идеальным: 13 существенных генов имели фатальные ошибки, которые убили E.coli, когда сегмент ДНК дикого типа был удален.

"Мы ожидали, что будут так называемые синонимичные, или молчащие позиции, которые на самом деле не синонимичные и не молчащие, где мы будем перекрывать регуляторные элементы или вторичные структуры," говорит Черч. Для устранения этих ошибок, исследователи точно определили каждый отдельный проблемный кодон и протестировали замену на по-прежнему синонимические последовательности.

"Это немного удивительно видеть, как пластичен может быть геном", говорит Патрик Каи (Patrick Cai), синтетический биолог из Университета Эдинбурга (University of Edinburgh), который не был вовлечен в исследование. "Это также очень интересно видеть, [что] технологии, такие как вычислительный дизайн, de novo синтез и сборка, а также целый ряд анализов фенотипирования, теперь готовы для перестроек генома в таком масштабе."

Команда должна еще закончить проверки остальных синтезированных сегментов ДНК, а затем объединить их in vivo. "Это, конечно, захватывающая статья с четкими достижениями", говорит Патрик О'Донохью (Patrick O’Donoghue), биохимик в Западном университете (Western University) в Канаде, который не был вовлечен в исследование. О'Донохью указал на два ключевых вопроса, которые представляют собой будущие препятствия в этой области: во-первых, предотвращение мутирования заменённых кодонов обратно в исходное геномное состояние; во-вторых, если кодоны когда-нибудь будут вновь введены с соответствующими тРНК для вставки неканонических аминокислот, предотвращения их трансляции нормальными почти родственными тРНК. "Штаммы, по направлению к которым они работают будут полезны, но, очевидно, будут некоторые технологические проблемы," добавил он.

"Следующая статья, которая, надеюсь, появится в ближайшее время, будет посвящена «полировке» генома и началу тестирования таких вещей, как мультивирусное сопротивление, определение количества аминокислот, которое мы можем загрузить, и подтверждение биоизоляции," говорит Черч.

N. Ostrov et al., “Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome,” Science, doi:10.1126/science.aaf3639, 2016.

Перевод оригинальной статьи Карен Зуси (Karen Zusi) на сайте журнала Ученый.

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/46840/title/Streamlining-the-E-coli-Genetic-Code/

#evrogenscience # E.coli #кодон #генетическийкод

Post has attachment
Рады сообщить Вам о нашем новом продукте:

Референсный краситель ROX для ПЦР-РВ:
HighROX (Кат#PB023) и LowROX (Кат#PB024)

http://evrogen.ru/products/PCR-kits/ROX.shtml

Post has attachment
Photo

Post has attachment
Борьба с устойчивость к антибиотикам через более глубокое секвенирование

Исследователи разработали новую методику, чтобы обнаружения редких мутаций в бактериальном геноме и использовали ее, чтобы определить, как определенные антибиотики мутируют ДНК. Как этот подход поможет в борьбе с устойчивостью к антибиотикам?

В почве, покрывающей поверхность земли, живут и растут бактерии; когда они сталкиваются с бактериальными конкурентами, они нападают и убивают, используя арсенал биологически активных молекул, чтобы сохранить свою территорию. Но, когда химические вещества двигаются дальше от своей цели, их концентрация уменьшается до сублетальных доз; и вместо того, чтобы убивать вражеские бактерий, вещества отбирают бактерии, которые содержат множество спонтанных мутаций, придающих устойчивость к веществу.

Так было с бактериями в течение миллионов лет: они нападают при помощи антибиотиков и защищаются при помощи устойчивости. Только в последнее время люди стали включены в эту химическую войну и использовали антибиотики не только для борьбы с болезнями человека, но, и чтобы способствовать росту поголовья скота. Теперь, спустя десятилетия после того, как мы впервые стали использовать силу антибиотиков, бактерии используют свою защиту в мучительных размерах, ставя нас на грань катастрофы с устойчивостью к антибиотикам.

"Это действительно тревожная ситуация, я думаю, что сейчас это все понимают ", говорит Евгений Нудлер (Evgeny Nudler), микробиолог из Школы Медицины Нью-йоркского университета (New York University School of Medicine). "Это идеальный шторм: в источнике снабжения становится меньше новых антибиотиков, и эти новые антибиотики, которые выходят на рынок не являются целыми новыми классами антибиотиков. Нам нужен принципиально новый подход ".

Лаборатория Нудлера является пионером в разработке одного нового подхода для исследования вопросов устойчивости к антибиотикам, путем лучшего понимания мутаций, которые приводят к этому. Они создали сверхчувствительный новый метод, который использует мощь секвенирования следующего поколения, чтобы точно определить редкие мутации в геноме бактерий. Метод представлен в журнале Nature (1). "Я думаю, что это будет иметь огромное влияние. Ни один метод не давал сочетание коррекции ошибок и выхода, который был достаточно высок, " говорит соавтор Авирам Расули (Aviram Rasouly) из Нью-Йоркского университета.

Иголка в стоге сена

Еще в первой половине 20-го века, ученые не были убеждены в том, что бактерии эволюционировали таким же образом, что и животные, через естественный отбор действующий на спонтанные мутации. В 1943 г. С. Э. Лурия (S. E. Luria) и М. Дельбрюк (M. Delbruck) провели классический (позднее принесший Нобелевскую премию) эксперимент (2): они выращивали бактерии в пробирке, а затем высевали их на двух разных чашках, содержащих бактериофаги T1. Если T1 заставлял бактерии мутировать, каждая чашка должна содержать примерно одинаковое количество колоний. Если мутации были спонтанными, каждая чашка должна содержать значительно различное число бактериальных колоний, так как мутации устойчивости могли возникнуть во время любого из предыдущих бактериальных поколений, и они могли присутствовать во многих бактериях (в начале процесса) или нескольких бактериях (в конце процесс). Оказалось, что в бактериях присутствует постоянный уровень случайных мутаций; в результате спонтанные мутации являются движущей силой, которая поддерживает разнообразие бактерий.

Хотя он по-прежнему используется для изучения частоты мутаций сегодня, метод Лурия и Дельбрюка может обнаружить только небольшой процент мутаций, которые вызывают устойчивость у бактерий. Мутации редки, потому что бактерии прекрасно реплицируют ДНК без ошибок: только 1 из 10 ^ 9 оснований на поколение имеет мутацию. И даже с современными методами очень трудно найти эти редкие мутации, отчасти потому, что существующие методы имеют свои собственные проблемы: секвенатор используемый при секвенировании следующего поколения считывает с ошибкой в 1 из 10 ^ 3 оснований и полимеразы, используемые в ПЦР, даже высокоточные, создают мутации в 4 из 10 ^ 6 оснований.

Поэтому недавно исследователи разработали другие методы на решение этой проблемы. В 2011 году исследователи создали баркодирование (3): где уникальный идентификатор (так называемый баркод) прикрепляется к интересующей области на каждой молекуле ДНК, которые затем амплифицируется с помощью ПЦР. ПЦР-продукты секвенируются, и, если более 95% продуктов содержат одинаковую мутацию, то она считается истинной мутацией.

Но выход был низким и оставались ошибки ПЦР. Поэтому, в 2012 году ученые создали так называемое дуплексное баркодирование (4). Здесь исследователи присваивали баркод каждой цепи ДНК, а затем ПЦР амплифицировали ее. Поскольку ошибки ПЦР происходят только на одной или на другой нити, истинные мутации будут найдены в том же положении на обеих нитях.
К сожалению, несмотря на то, что технология была более точной, выход был еще ниже.

Так что Джастин Джи (Justin Jee ), аспирант в группах Нудлера и Бада Мишра (Bud Mishra) в Нью-Йоркском университете, работал с постдоком Ильей Шамовским (Ilya Shamovsky), чтобы развить идею для обнаружения чрезвычайно редких мутаций в любой области, представляющей интерес в популяции бактериальных клеток. Они назвали свой метод секвенирование максимальной глубины (СМГ), метод с исправлением ошибок и использованием секвенирования следующего поколения (1).

"Идея была в том, чтобы придумать какую-то четкую методологию, которую мы можем использовать для измерения уровня мутаций непосредственно у бактерий, независимо от выбора," говорит Нудлер.

Команда добавила уникальный баркод в интересующую область в каждой части исходной ДНК из образца бактерий, а затем использовала линейный ПЦР, чтобы скопировать интересующую область. Затем они секвенировали каждую область и разработали алгоритм, чтобы найти типичный код в этом регионе, тем самым устраняя мутации, введенные полимеразой. Это увеличило выход, но уменьшило ошибки от полимеразы и секвенирования. "Таким образом, мы можем произвести много копий исходной последовательности и сравнить их с помощью баркода, чтобы отсеять ошибки в последовательности, введенные с помощью ПЦР и выявить подлинные варианты или новые мутации," говорит Нудлер.

"Экспериментально мы показали в статье, что мы можем достоверно обнаруживать мутации, возникающие в частоте 1 из 1,000,000," добавляет Расули.

Влияние антибиотиков

Имея метод СМГ в руках, команда исследовала частоту мутаций в шести 100-нуклеотидных областях, представляющих интерес в E.coli, показав, что частота мутаций значительно различается. Интересно отметить, что многие из этих ошибок исправляются in vivo.

Затем исследователи использовали СМГ для изучения влияния антибиотиков на частоту мутаций при воздействии на бактерии сублетальными дозами ампициллина (бета-лактам) и норфлоксацина (фторхинолонов). Ампициллин вызвал увеличение уровня переходных мутаций в одной интересующей области в E.coli, картина, которая указывает на понижение репарации неспаренных нуклеотидов. В клетках, которые производят слишком много каталазы, уровень мутаций уменьшился в восемь раз, что указывает на то, что фоновое окисление играет роль. Таким образом, говорит Нудлер, ампициллин, вероятно, вызывает оксидативный стресс, подавляющий репарацию неспаренных нуклеотидов, тем самым увеличивая частоту мутаций.

Другой антибиотик, который они испытали, норфлоксацин, увеличил формирование > 1bp инделов в двух из протестированных интересующих регионах. Этот препарат может вызвать двухцепочечные разрывы ДНК, мутируя бактерии, которые он должен убить.

Поразительно, что антибиотики сами мутируют бактериальную ДНК посредством понижения репарации неспаренных нуклеотидов с помощью окислительного стресса, конфликтов транскрипции-репликации и прямого повреждения ДНК. "Понимание этих вещей может привести вас к совершенно новым путям для улучшения ситуации с устойчивости к антибиотикам," говорит Нудлер, в том числе работая с окислительным стрессом и ингибированием производства сульфида.

"Это то, что будет расширяться за пределы области устойчивости к антибиотикам," говорит Расули. Забегая вперед, Нудлер и его лаборатория планируют использовать метод, чтобы найти мутации в циркулирующей опухолевой ДНК пациентов, сосредоточив внимание на мутациях в генах с потенциальной прогностической или лечебной релевантностью.

1) Jee J, Rasouly A, Shamovsky I, Akivis Y, Steinman SR, Mishra B, Nudler E. Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing. Nature, 30 June 2016, 534, 693-6.
2) Luria, SE & Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics, 1943, 28, 491–511.
3) Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, Vogelstein B. Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proc Natl Acad Sci, 2011 Jun 7;108(23):9530-5.
4) Schmitt MW, Kennedy SR, Salk JJ, Fox EJ, Hiatt JB, Loeb LA. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc Natl Acad Sci, 2012 Sep 4;109(36):14508-13.

Перевод оригинальной статьи Мулера Гормана (Moeller Gorman) на сайте журнала Биотехнологии.


http://www.biotechniques.com/news/Fighting-Antibiotic-Resistance-Through-Deeper-Sequencing/biotechniques-364985.html#.V76yFPmLSUk

#evrogenscience #секвенирование #мутации
Wait while more posts are being loaded